基因测序技术从Sanger测序走向高通量NGS，再迈向三代测序，其核心拐点正是围绕“PCR扩增”这一环节的路线之争。从罗氏454的焦磷酸测序、Illumina的桥式PCR，到华大智造的DNB纳米球技术，每一次更迭都在解决通量、成本与准确性的矛盾。当前，NGS仍是商业化主流，而无需PCR扩增的三代测序正在形成互补格局。
关键拐点一：454退出与桥式PCR的崛起
NGS早期，罗氏454的焦磷酸测序率先实现了高通量，但其测序通量和成本始终限制技术推广，罗氏在2016年底终止了454公司的NGS测序业务。与此同时，Illumina凭借桥式PCR扩增与边合成边测序结合的技术路线奠定霸主地位，其检测准确性高、通量覆盖广，不同机型单次运行通量范围为1.2-6000Gb。不过，桥式PCR的短板同样明显：PCR扩增技术会导致错误累积，且搭配的生化技术会产生标签跳跃，需使用双接头弥补。
关键拐点二：华大智造DNB纳米球的差异化突围
华大智造的技术路线走了一条不同的路。2013年，华大收购Complete Genomics进入上游制造领域——CG公司虽有专利和早期技术，但并不意味着能直接转化出量产且成功的基因测序仪，产品需通过使用者磨合来打磨迭代。华大智造最终发展出DNA纳米球与联合探针锚定聚合相结合的DNBSEQ路线：建库时将DNA片段环化，通过滚环扩增形成DNA纳米球，再固定在阵列化芯片上测序。相比桥式PCR，DNB技术产出数据重复序列率低，能有效减少数据浪费，通量覆盖更广（0.25-72000Gb），并支持自动化。这一路线也绕开了Illumina密集的专利网——后者在全球布局专利超12000项，并多次对同行发起专利诉讼。
关键拐点三：三代测序的挑战与共存
2011年后，以PacBio SMRT和Oxford Nanopore纳米孔单分子技术为代表的三代测序兴起，其最大特点是单分子测序，无需PCR扩增，理论上可测定无限长度的核酸序列。但三代测序单条序列错误率仍较高，平均成本也高于NGS。因此，NGS仍是目前基因测序大规模商业化应用的主要推动力，三代测序则在长读长等特定场景形成补充。
常见问题
华大智造DNBSEQ与Illumina桥式PCR的核心区别是什么？
核心在于扩增方式：Illumina采用桥式PCR，扩增过程会累积错误并产生标签跳跃；华大智造DNBSEQ采用滚环扩增形成DNA纳米球，数据重复序列率低、数据浪费少，且通量覆盖范围更广。
罗氏454为何退出历史舞台？
罗氏454的焦磷酸测序虽然率先实现高通量，但测序通量和成本始终限制其技术推广，最终在2016年底终止了NGS测序业务。
三代测序会取代NGS吗？
短期内不会。三代测序无需PCR扩增、读长更长，但单条序列错误率较高、平均成本较高；NGS仍是目前大规模商业化应用普及的主要推动力，两者更多是互补共存的关系。