业界常说的“四代测序”，本质上就是第三代单分子测序技术，这一叫法并非公认的技术代际划分。单分子测序无需PCR扩增，直接对单条DNA分子进行测序，其产业链上游的核心部件因技术路线不同而各异，主要包括蛋白纳米孔、零模波导（ZMW）、荧光标记dNTP、motor蛋白及人造膜等。
单分子测序有两条主流技术路线：PacBio 技术与 Nanopore 技术。前者利用荧光信号识别碱基，后者通过电流阻断识别碱基。牛津纳米孔（ONT）的 Nanopore 技术因商业化较晚，常被称为“第四代”，但行业共识是它仍属于第三代单分子测序。
上游核心部件构成
**Nanopore 技术路线（ONT 为代表）**的核心上游部件包括：
- 蛋白纳米孔：经过改造的蛋白通道，置于人造膜上，是测序的核心传感元件
- 人造膜：承载蛋白纳米孔的脂质双分子层结构，对膜两侧施加电压差产生电流
- motor 蛋白：负责牵引 DNA 或 RNA 解旋为单链并进入纳米孔
- 模式识别算法：记录并解析不同碱基通过纳米孔时产生的电流变化
PacBio 技术路线的核心上游部件则包括：
- 零模波导（ZMW）：单分子实时测序的核心单元，每个纳米孔只允许一条 DNA 模板进入
- 荧光标记 dNTP：四种不同颜色荧光标记的核苷酸，通过荧光信号时间差异识别碱基序列
- DNA 聚合酶：与模板结合，驱动测序反应
技术壁垒与产业格局
| 核心部件 | 所属技术路线 | 技术特点 |
|---|---|---|
| 蛋白纳米孔 | Nanopore | 蛋白工程改造难度高，需保持通道稳定与电流信号灵敏 |
| 零模波导 ZMW | PacBio | 纳米级光学结构，对制造精度要求极高 |
| 荧光标记 dNTP | PacBio | 需与聚合酶、模板高效匹配，信号区分度要求高 |
| motor 蛋白 | Nanopore | 牵引速率与纳米孔电流检测需精密协同 |
在产业端，国内初创公司正试图在上游关键部件上实现自主可控。以齐碳生物为例，这家专注于纳米孔长读长测序的初创公司，在2022年完成了当年国内生命科学领域一级市场上最大的一笔融资，金额高达7亿元，显示出资本对国产纳米孔测序上游技术突破的认可。
常见问题
为什么“四代测序”和“三代测序”经常混用？
ONT 发明的 Nanopore 技术有时被称为第四代基因测序技术，但这属于人造的商业代际概念。行业的普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术，第四代与第三代之间不存在代际差异。
三代测序相比二代测序的核心优势是什么？
三代测序属于长读长测序，无需扩增、从头读到尾，可避免二代测序在重复序列区域的拼接偏差。2023年初，国际顶级期刊 Nature Methods 将长读长测序评选为“2022年度最佳技术”，认可其在完整基因组组装中的不可替代作用。
上游核心部件是否依赖进口？
当前全球范围内，ONT 和 PacBio 在各自技术路线的核心部件上均有深厚积累。国内方面，以齐碳生物为代表的初创公司正推进纳米孔测序相关上游部件的自主研发，但整体国产化进程仍处于发展初期，具体供应格局建议以各厂商官方披露为准。