三代测序（单分子测序）目前主要有两条技术路线：PacBio 走荧光信号识别，Nanopore 走电流阻断识别，二者壁垒并不在同一维度上，PacBio 的壁垒更集中在核心光学单元与聚合酶体系的长期积累，Nanopore 的壁垒更集中在蛋白纳米孔改造与模式识别算法。行业普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术，二者同属长读长路线，谈不上谁全面压倒谁。
两条路线的识别原理不同
PacBio 技术把荧光标记的不同碱基、待测序列与 DNA 聚合酶一起放入纳米孔底部，每个纳米孔只允许一条 DNA 模板进入，模板与聚合酶结合后加入 4 种不同颜色荧光标记的 dNTP，通过荧光信号时间的不同识别碱基序列。其核心单元零模波导 ZMW 的最初模型，最早见于 2003 年 Science 杂志以封面形式发表的文章。
Nanopore 技术则是改造蛋白通道形成用于核酸检测的蛋白纳米孔，将其置于人造膜上，对膜两侧施加不同电压差，纳米孔产生电流；motor 蛋白牵引 DNA 或 RNA 到纳米孔后解成单链，不同碱基导致不同电流变化，再通过记录电流变化并用模式识别算法确定碱基序列。
工程化难度与壁垒侧重
从工程化角度看，PacBio 路线涉及荧光标记、光学检测与聚合酶体系的协同，核心单元的原始模型可追溯到 2003 年，长期积累构成门槛；Nanopore 路线的门槛则在于蛋白纳米孔的改造与电流信号的模式识别算法，其技术原型可追溯到 1996 年 PNAS 发表的文章。
在设备形态与场景适配上，Nanopore 路线表现突出：目前使用最成熟的 MinION 测序仪可在极地、海洋甚至太空等各种复杂环境下完成实时测序，可保证对突发疫情处理的时效性。
| 对比维度 | PacBio | Nanopore |
|---|---|---|
| 识别方式 | 荧光标记碱基、荧光信号时间 | 蛋白纳米孔电流变化、模式识别算法 |
| 壁垒侧重 | 核心光学单元与聚合酶体系 | 蛋白纳米孔改造与算法 |
| 便携与场景 | 资料未展开 | MinION 可在极地、海洋、太空测序 |
共同的瓶颈
两条路线共享三代测序的技术特点：读长原则上不受限，目前最长读长可达 2.4 M；可实时测序，边测序边输出结果；可直接对 RNA 测序，避免逆转录扩增带来的偏向性与可能引入的突变。但三代测序当前准确率仍只能做到 95%，这是两条路线共同面对的技术瓶颈。
常见问题
PacBio 和 Nanopore 谁的壁垒更高？
两者壁垒不在同一维度：PacBio 的核心单元 ZMW 自 2003 年 Science 封面文章起积累，壁垒偏光学与酶体系；Nanopore 依赖蛋白纳米孔改造与算法，壁垒偏蛋白工程与信号解析。判断高低需结合具体应用场景，不宜一概而论。
为什么 Nanopore 常被称为第四代测序？
Oxford Nanopore Technologies 发明的 Nanopore 技术经常被称为第四代基因测序技术，但业内普遍观点认为这个第四代属于人造的商业代际，并没有太大意义。行业普遍共识仍是：单分子测序技术就是第三代测序技术。
三代测序目前最大的技术瓶颈是什么？
主要是准确率，目前仍只能做到 95%。此外，二代测序把 DNA 扩增后切成不超过 200BP 的片段读取再用算法还原，三代测序不用扩增、从头读到尾，长读长优势明显，但准确率短板制约了其在临床商业转化上的推进节奏。