三代基因测序即单分子测序，其核心特征是测序时无需进行 PCR 扩增，基于单分子的电信号或化学反应信号检测，实现对每一条 DNA 分子的单独测序，并可边测序边输出结果、支持实时分析。行业普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术。当前格局可概括为：PacBio 与 Oxford Nanopore Technologies（ONT）分踞荧光与纳米孔两条技术路线，illumina 代表的二代测序仍占据最大市场份额，而 illumina、华大智造、齐碳生物等新老玩家的长读长布局，正推动竞争从二代独大走向多元演进。
两条技术路线：荧光信号与电流阻断
单分子测序可根据碱基的荧光或者电流阻断识别碱基序列，对应 PacBio 技术与 Nanopore 技术两条路线。
PacBio 技术将荧光标记的不同碱基、待测序列与 DNA 聚合酶一起放入纳米孔底部，每个纳米孔只允许一条 DNA 模板进入，模板进入后与 DNA 聚合酶结合，加入 4 种不同颜色荧光标记的 dNTP，通过荧光信号时间的不同识别碱基序列。
Nanopore 技术则通过改造蛋白通道形成用于核酸检测的蛋白纳米孔，将其置于人造膜上，对膜两侧施加不同电压差，纳米孔产生电流；当 motor 蛋白牵引 DNA 或 RNA 到纳米孔，DNA 解开成单链，不同碱基通过时会导致不同的电流变化，通过记录电流变化并用模式识别算法确定碱基序列。
时间线：三代起步不晚，二代先占市场
三代测序的起步甚至更早：2000 年，PacBio 的前身 Nanofluidics, Inc. 在美国加州成立；2005 年，ONT 从英国牛津大学衍生出来，开始独立运营。但商业化节奏偏慢——PacBio 第一款商业化机型 PacBio RS 直到 2010 年才推向市场，ONT 直到 2012 年 AGBT 会议才展示第一款掌上测序仪 MinION，其后到 2015 年才开始正式商业化。而此时已是以 illumina 为代表的二代测序的天下：illumina 密集推出多款机型，凭借测序系统的出色性能迅速攻占科研和临床市场，最终占据了最大市场份额。
格局演变：从二代独大到多元竞争
三代测序的优势在读长与实时性，短板则在准确率——目前准确率仍然只能做到 95%，过去十年市占率不到 10%，应用多局限于基础科学研究。转折来自科学界的认可：2022 年 4 月，端粒到端粒联盟（T2T）利用长读长技术完成首个真正完整的人类基因组序列；2023 年初，Nature Methods 将长读长测序评选为“2022 年度最佳技术”。
产业端的动作同样密集。收购 PacBio 失败后，illumina 在长读长方向的探索并未停止，并于 2022 年年初宣布将推出自己的长读长产品 Infinity，外界普遍猜测其将采用合成长读长测序技术。此外，华大智造、Element Biosciences、Ultima Genomics 都计划或已经开始布局长读长测序领域；PacBio 于 2022 年 10 月宣布推出公司史上最高通量 Revio 长读长测序系统；齐碳生物在 2022 年完成 7 亿元 C 轮融资，为当年国内生命科学领域一级市场最大一笔融资。应用端，贝瑞基因持续发力三代测序临床转化，截至 2022 年底累计服务三代测序检测样本量突破 10 万人份，服务终端客户超过 1500 家。
常见问题
三代基因测序和二代测序最本质的区别是什么？
行业内的通俗比喻是：二代测序是短读长，把 DNA 扩增后切成不超过 200BP 的片段读取，再用算法还原；三代测序是长读长，不用扩增，从头读到尾。因此二代难以精准测出基因组中常见的重复序列，而三代测序原则上对测序长度没有限制，目前最长读长可达 2.4 M。
PacBio 和 Nanopore 是不是同一代技术？
两者都属于单分子测序，即第三代测序技术，区别在于识别碱基的物理信号不同：PacBio 基于荧光信号时间差异，Nanopore 基于碱基通过纳米孔时的电流变化。ONT 的 Nanopore 技术常被称为第四代基因测序，但业内普遍观点认为这个代际划分属于人造的商业代际，行业普遍共识仍是单分子测序即三代测序。
三代测序会取代二代测序吗？
从当前格局看，illumina 代表的二代测序仍占据最大市场份额，三代测序过去十年市占率不到 10%，且准确率目前只能做到 95%。但 illumina 已宣布推出长读长产品 Infinity，华大智造、Element Biosciences、Ultima Genomics 等也在布局长读长领域，格局更可能从二代独大走向多元并存，而非简单替代。