三代基因测序（单分子测序）的起步其实早于二代测序的普及：PacBio 前身 Nanofluidics 于 2000 年在美国加州成立，ONT 于 2005 年从牛津大学衍生，而纳米孔测序的技术原型更可追溯至 1996 年 PNAS 发表的相关文章。此后经历 2010 年 PacBio 首款商业化机型 PacBioRS 上市、ONT 2015 年正式商业化、被 illumina 抢占最大市场份额，再到 2022 年 T2T 联盟完成首个真正完整的人类基因组序列、2023 年 Nature Methods 将长读长测序评为“2022 年度最佳技术”，构成三代测序的关键拐点链条。
起步更早：三代测序的时间线并不晚于二代
行业的普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术。它包含两条技术路线：以荧光信号识别碱基的 PacBio 技术，和以电流阻断识别碱基的 Nanopore 技术（由 ONT 发明，常被称作第四代，但业内普遍认为这一“第四代”属于人造的商业代际）。
从时间看，三代测序的起步甚至更早：2000 年 PacBio 前身成立；2003 年 Science 以封面形式发表零模波导 ZMW 的最初模型文章，这是 PacBio 单分子实时测序的核心单元；2005 年 ONT 从牛津大学衍生并独立运营。而当时，二代测序的代表 illumina 还在卖基因芯片。
商业化滞后：被二代压制的那十年
三代测序的技术优势明确，但商业化节奏偏慢。直到 2010 年，PacBio 第一款商业化机型 PacBioRS 才推向市场；ONT 则在 2012 年 AGBT 会议上展示首款掌上测序仪 MinION，到 2015 年才开始正式商业化。此时已是以 illumina 为代表的二代测序的天下——illumina 密集推出多款机型，凭借测序系统的出色性能迅速攻占科研和临床市场，最终占据最大市场份额。
二代测序被称为“短读长”，三代测序被称为“长读长”：二代把 DNA 扩增后切成不超过 200BP 的片段读取，再用算法还原，基因组中常见的重复序列难以精准测出；三代不用扩增、从头读到尾，但最大的问题是准确率，目前仍只能做到 95%。因此在过去十年中，三代测序市占率不到 10%，应用多局限于基础科学研究，临床商业转化寥寥。
关键拐点：T2T 补齐最后 8% 与年度最佳技术
变化发生在近年。2022 年 4 月，Science 杂志连发 6 篇文章，报道由端粒到端粒联盟（T2T）完成的首个真正完整的人类基因组序列，这是人类基因组计划发起 30 年后又一重大里程碑事件。为补齐人类基因组序列最后的 8%，三代测序起到了不可替代的作用。
2023 年初，国际顶级期刊 Nature Methods 将长读长测序（三代测序）评选为“2022 年度最佳技术”，众多科学家相信，“Long-read sequencing is the future”。产业端同步升温：illumina 宣布推出长读长产品 Infinity；Element Biosciences 收购 Loop Genomics；Pacific Biosciences 推出公司史上最高通量 Revio 长读长测序系统；齐碳生物完成 7 亿元 C 轮融资；贝瑞基因截至 2022 年底累计服务三代测序检测样本量突破 10 万人份，服务终端客户超过 1500 家。
常见问题
三代测序和二代测序是替代关系吗？
不是简单的替代。二代测序读长短但准确率高、成本低，三代测序读长长、无需 PCR 扩增、可实时测序并直接测 RNA，两者在应用上各有侧重。三代测序目前准确率仍只能做到 95%，这也是其临床转化需要持续突破的原因之一。
T2T 计划为什么被视为三代测序的转折点？
T2T 联盟于 2022 年 4 月完成首个真正完整的人类基因组序列，补齐了此前人类基因组序列最后的 8%。资料明确指出，在这一过程中三代测序起到了不可替代的作用，因此被视为三代测序从基础科研走向更大舞台的重要里程碑。
三代测序的临床应用进展如何？
产业端正在迎来新的突破。贝瑞基因截至 2022 年底累计服务三代测序检测样本量突破 10 万人份，服务终端客户超过 1500 家；检验医学顶级国际期刊 CLINICAL CHEMISTRY 专门发表编辑部文章，认为三代测序技术为复杂单基因病的分子诊断带来了全新机遇。