第三代基因测序即单分子测序，其技术原型可追溯到更早年代的膜通道检测研究。行业普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术，主要包括 PacBio 与 Nanopore 两条技术路线；2022 年 T2T 联盟完成首个真正完整的人类基因组序列、2023 年 Nature Methods 将长读长测序评为“2022 年度最佳技术”，被视为关键拐点。
技术原型与公司起源
三代测序的起步甚至比许多人想象的更早。纳米孔测序的技术原型，可追溯到 1996 年 PNAS 发表的一篇题为“用膜通道检测多核苷酸序列”的文章。2000 年，PacBio 的前身 Nanofluidics, Inc. 在美国加州成立；2003 年，Science 杂志以封面形式发表了零模波导 ZMW 的最初模型，这成为 PacBio 单分子实时测序的核心单元。2005 年，ONT 从英国牛津大学衍生出来，开始独立运营。彼时，二代测序代表 illumina 还在销售基因芯片。
商业化落地的时间差
直到 2010 年，PacBio 第一款商业化机型 PacBioRS 才推向市场；ONT 则到 2012 年的 AGBT 会议上才展示第一款掌上测序仪 MinION，其后到 2015 年才开始正式商业化。此时已是以 illumina 为代表的二代测序的天下，其密集推出多款机型，迅速攻占科研和临床市场。三代测序在过去十年中市占率不到 10%，应用多局限于基础科学研究。
两个关键拐点
2022 年 4 月，Science 杂志连发 6 篇文章，报道由端粒到端粒联盟（T2T）完成的首个真正完整的人类基因组序列，这是人类基因组计划发起 30 年后的又一重大里程碑，三代测序在补齐人类基因组序列最后的 8% 中起到了不可替代的作用。2023 年初，Nature Methods 将长读长测序（三代测序）评选为“2022 年度最佳技术”。
| 领域 | 时间 | 对象 | 主要事件 |
|---|---|---|---|
| 科学界 | 2022年4月 | T2T 联盟 | 利用长读长技术完成首个真正完整的人类基因组序列 |
| 科学界 | 2023年1月 | Nature Methods | 将长读长技术评选为2022年年度最佳技术 |
| 制造端 | 2022年初 | illumina | 宣布推出长读长相关产品 Infinity |
| 制造端 | 2022年10月 | Pacific Biosciences | 宣布推出公司史上最高通量 Revio 长读长测序系统 |
| 投融资界 | 2022年12月 | 齐碳生物 | 完成7亿元C轮融资 |
| 应用端 | 2022年 | 贝瑞基因 | 累计服务三代测序检测样本量突破10万人份 |
常见问题
三代测序和二代测序的核心区别是什么？
二代测序被称为短读长，需将 DNA 扩增后切成不超过 200BP 的片段读取，再用算法还原；三代测序被称为长读长，不用扩增，从头读到尾。二代测序对基因组中常见的重复序列难以精准测出，而三代测序原则上对测序长度没有限制。
为什么会有“第四代测序”的说法？
ONT 发明的 Nanopore 技术经常被称为第四代基因测序技术，容易造成混淆。业内普遍观点认为，这个第四代属于人造的商业代际，并没有太大意义，行业共识仍是单分子测序技术即第三代测序技术。
三代测序目前的主要短板是什么？
三代测序最大的问题是准确率，目前仍只能做到 95%，即容易在读取时出现碱基识别错误。这也是其过去十年市占率不到 10%、应用多局限于基础科学研究的原因之一。