从PacBio到ONT再到T2T，长读长测序技术走过了从概念验证到主流应用的二十年历程：2000年PacBio前身成立，2005年ONT从牛津大学衍生，2010年PacBio推出首款商业化机型，2015年ONT正式商业化，2022年T2T联盟完成首个真正完整的人类基因组序列，2023年长读长测序被Nature Methods评为年度最佳技术。这条技术路线在二代测序主导的时代艰难突围，最终凭借不可替代的技术优势赢得了科学界的认可。
三代测序的两条技术路线
长读长测序（即三代测序）的核心是单分子测序技术，测序时无需PCR扩增，直接对每一条DNA分子单独测序。行业普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术。该技术有两条路线：PacBio技术利用荧光标记的dNTP与DNA聚合酶在纳米孔底部结合，通过荧光信号时间差异识别碱基序列；Nanopore技术（由Oxford Nanopore Technologies，即ONT发明）则通过蛋白纳米孔置于人造膜上，施加电压差产生电流，不同碱基通过时产生不同的电流干扰，由模式识别算法确定碱基序列。
在二代测序主导下的艰难起步
长读长技术的起步并不晚于二代测序。2000年PacBio前身Nanofluidics, Inc.在美国加州成立；2003年Science封面文章发表了零模波导ZMW的最初模型；2005年ONT从牛津大学衍生独立运营。然而商业化进程缓慢——PacBio直到2010年才推出首款商业化机型PacBioRS，ONT则在2012年才展示掌上测序仪MinION原型，2015年才开始正式商业化。此时二代测序已凭借出色性能和密集机型迭代占据最大市场份额。用通俗比喻来说，二代短读长测序是把一首歌切成三个字的片段再用算法复原，三代长读长测序则是从头唱到尾。短读长在重复序列区域容易出错，而长读长的主要短板在于准确率，官方资料显示当时准确率仍只能做到95%。过去十年中，三代测序市占率不到10%，应用多局限于基础科学研究。
技术成熟与科学认可的双重拐点
长读长测序的转折发生在2022年。2022年4月，Science杂志连发6篇文章，报道端粒到端粒联盟（T2T）完成的首个真正完整的人类基因组序列——这是人类基因组计划发起30年后的又一重大里程碑，为补齐人类基因组序列最后的8%，三代测序起到了不可替代的作用。2023年初，Nature Methods将长读长测序评选为“2022年度最佳技术”，众多科学家相信“Long-read sequencing is the future”。
产业端同步迎来突破：测序巨头illumina在收购PacBio失败后，于2022年初宣布推出长读长产品Infinity；华大智造、Element Biosciences等也布局长读长领域；专注于纳米孔测序的齐碳生物在2022年完成了7亿元融资；应用端贝瑞基因截至2022年底累计服务三代测序检测样本量突破10万人份，其三代地贫检测效能受到检验医学期刊CLINICAL CHEMISTRY关注，该刊编辑部文章认为三代测序技术为复杂单基因病的分子诊断带来了全新机遇。
常见问题
三代测序和第四代测序是什么关系？
行业普遍共识是，单分子测序技术就是第三代测序技术。ONT的Nanopore技术有时被称为第四代基因测序，但这属于人造的商业代际，并没有实质性的代际差异。
长读长测序相比短读长测序的核心优势是什么？
长读长测序无需PCR扩增、可从头读到尾，对测序长度没有限制，能精准读取基因组中常见的重复序列区域，这是短读长测序的短板。此外还可实时测序、设备便携，并能直接对RNA测序。
长读长测序技术目前准确率如何？
官方资料显示，长读长测序此前准确率只能做到95%，主要问题是碱基识别错误。但凭借在T2T完整人类基因组等重大科学项目中的不可替代作用，该技术已获得科学界与产业界的高度认可，临床应用转化正在持续推进。