基因测序的三代演进，关键拐点集中在“读长”的突破上：第一代Sanger法准确但昂贵，第二代NGS便宜好用却受限于短读长与复杂文库构建，第三代单分子测序无需PCR扩增、基于单分子电信号或化学反应信号逐条测序，其中Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION掌上测序仪把纳米孔测序带到了极地、海洋甚至太空等复杂环境；此后T2T联盟完成首个无GAP人类全基因组、长读长测序获评年度最佳技术，三代测序从基础科研走向临床转化。

从Sanger到单分子：三代技术怎么分

第一代Sanger法准确但昂贵；第二代NGS便宜又好用，但文库构建复杂繁琐、测序读长短、序列分析时间长。第三代即单分子测序，测序时不需要PCR扩增，基于单分子的电信号或化学反应信号检测，实现对每一条DNA分子的单独测序。

单分子测序有两条路线：PacBio利用荧光标记碱基，通过荧光信号时间差异识别序列；Nanopore则改造蛋白通道，当motor蛋白牵引DNA或RNA穿过纳米孔，不同碱基产生不同电流变化，再以模式识别算法确定碱基序列。业内普遍共识是，单分子测序就是第三代测序技术。

通俗地说，二代是短读长——把DNA扩增后切成不超过200BP的片段读取再用算法还原；三代是长读长——不用扩增，从头读到尾，因而对重复序列的解析更具优势，但代价是准确率目前仍只能做到95%。

关键拐点：掌上测序仪与T2T完整基因组

  • 2000年，PacBio前身在美国加州成立；2003年，Science以封面形式发表零模波导ZMW的最初模型；2005年，ONT从牛津大学衍生、独立运营。
  • 2012年AGBT会议上，ONT展示首款掌上测序仪MinION，2015年开始正式商业化。MinION可在极地、海洋甚至太空等复杂环境下完成实时测序。
  • 2022年4月，Science连发6篇文章，报道端粒到端粒联盟（T2T）完成的首个真正完整的人类基因组序列，三代测序为补齐最后的8%起到不可替代的作用。
  • 2023年初，Nature Methods将长读长测序评选为“2022年度最佳技术”。

过去十年，三代测序市占率不到10%，应用多局限于基础科研，临床商业转化寥寥。转折正在发生：制造端，illumina宣布推出长读长产品Infinity，华大智造、Element Biosciences、Ultima Genomics等也在布局；应用端，贝瑞基因持续发力临床转化，截至2022年底累计服务三代测序检测样本量突破10万人份，服务终端客户超过1500家。

常见问题

MinION掌上测序仪的核心特点是什么？

它基于纳米孔测序原理，文库制备简单、无需PCR扩增，可边测序边输出结果，实现实时分析。其设备简单便携，目前使用最成熟的MinION可在极地、海洋甚至太空等复杂环境下完成实时测序，有助于保证突发疫情处理的时效性。

三代测序相比二代测序的优势和短板分别是什么？

优势在于长读长、可实时测序、设备便携，还能直接对各类形式的RNA测序，避免逆转录扩增带来的偏向性与可能引入的突变。短板是准确率目前仍只能做到95%，且在过去十年市占率不到10%，临床转化此前较为有限。

T2T完整基因组为什么被视为里程碑？

2022年4月，Science连发6篇文章报道T2T联盟完成首个真正完整的人类基因组序列，这是人类基因组计划发起30年后的又一重大里程碑。为补齐人类基因组序列最后的8%，三代测序起到了不可替代的作用。