NGS（高通量测序）建库过程中需通过 PCR 扩增富集待测序列，这一步骤可能引入碱基错配；叠加测序流程本身较为复杂，这类技术局限会给检测结果带来低频突变假阳性与漏检并存的不确定性，并可能进一步影响临床诊断与科研结论的可靠性。行业内通常以 UMI 纠错、正交验证等方式缓释上述风险，但无法完全消除。需要说明的是，NGS 仍是目前基因测序技术大规模商业化应用普及的主要推动力，并在未来一段时间内仍是主流技术。
错配如何转化为结果层面的不确定性
建库阶段的 PCR 扩增是错误累积的来源之一。以 Illumina 的桥式 PCR 扩增与边合成边测序结合的技术路线为例，其技术缺点即包括“PCR 扩增技术会导致错误累积，搭配的生化技术会产生标签跳跃（Index Hopping），需要使用双接头弥补”；Thermo Fisher 的乳液 PCR 扩增与半导体测序结合路线，同样存在“PCR 扩增技术会导致错误累积”的问题。当错配碱基被后续测序读取时，可能表现为样本中并不存在的变异信号，即假阳性；反之，若真实低频信号被背景噪声掩盖，则可能出现漏检。对肿瘤早筛、伴随诊断等对低频突变敏感的场景，这类不确定性会直接影响结果解读。
流程复杂度带来的操作与批次差异
NGS 测序过程较复杂，从建库、扩增、上机测序到生物信息处理环环相扣。以华大智造的测序技术为例，需先完成 DNA 碎片化与接头添加、环化得到单链环状 DNA，再经滚环扩增形成 DNA 纳米球，固定于阵列化测序芯片后，通过每轮与特定酶和荧光探针反应采集荧光信号，重复数百轮后再经去重和拼接获得序列。环节越多，操作误差与批次间差异的累积空间越大。测序仪使用者也普遍希望设备性能稳定、故障率低、测序错误率低、准确率高，而这依赖整个过程的集成与制造工艺，并需通过与使用者磨合来迭代提升。
临床合规视角下的风险敞口
临床级应用对假阳性的容忍度较低，错误结果可能引发报告召回与责任界定问题。从产业链看，上游仪器设备制造集多种交叉学科于一体、研发周期长、技术壁垒高，中下游测序服务竞争较为激烈，不同环节的质量控制能力差异会传导至最终结果。目前基因测序设备及耗材市场主要被海外龙头占据，2019 年 Illumina、Thermo Fisher、华大智造的全球市占率分别为 74.1%、13.6%、3.5%（以销售额计，华大智造招股书数据），国内市场中 Illumina、华大智造占比分别为 61%、24%。在这一格局下，选择具备完整质控与验证体系的平台尤为重要。
常见问题
PCR 错配一定会导致假阳性结果吗？
不一定。错配属于可能发生的技术局限，是否形成假阳性取决于错配是否被读取、信号强度以及后续生物信息处理与验证环节。通过 UMI 纠错、双接头策略、正交验证等手段可降低其影响，但难以完全排除。
为什么说 NGS 流程复杂会放大风险？
NGS 涵盖建库、扩增、上机测序与生物信息处理等多个环节，任一环节的操作误差或批次差异都可能累积并影响最终序列判读。流程越长、参与方越多，质量控制的一致性要求就越高。
肿瘤早筛和伴随诊断为何更关注这类风险？
这类应用常需识别样本中的低频突变信号，而 PCR 扩增导致的错误累积可能干扰对低频信号的判断。因此对建库与测序全流程的纠错能力和验证策略要求更高，具体性能表现建议以第三方实测与公开数据为准。