单分子测序（即第三代测序技术）无需 PCR 扩增或逆转录即可直接对 DNA 或 RNA 测序，能够规避 RNA 病毒研究中逆转录扩增带来的偏向性及可能引入的突变；但这条路线的主要风险与不确定性集中在准确率仍有提升空间、临床商业转化尚不充分、规模化应用基础较薄弱三个方面，同时还要面对二代测序长期占据最大市场份额的现实格局。
技术层面的不确定性：准确率与验证
单分子测序的两条技术路线——PacBio 技术与 Nanopore 技术——分别依据碱基的荧光信号或电流阻断信号识别序列，原理上各有侧重。其突出优势是读长长、可实时测序、设备简单便携，MinION 测序仪可在极地、海洋甚至太空等复杂环境下完成实时测序。
但长读长路线的短板同样明确：目前准确率仍只能做到 95%，存在“会唱错”的问题。这意味着在需要高置信度碱基判读的场景中，单分子测序的结果仍需与其它手段交叉验证，其准确性的边界与适用条件，也有待更多公开数据与第三方实测来确认。
产业层面的不确定性：临床落地与规模化
从市占率看，过去十年间三代测序市占率不到 10%，应用多局限于基础科学研究，临床商业转化寥寥。这一格局的成因不只是技术指标，还包括成本与规模化能力——而这两项目前均缺乏公开的统一口径数据，实际水平需以厂商公布及第三方实测为准。
变化正在发生：T2T 联盟利用长读长技术完成了首个真正完整的人类基因组序列；Nature Methods 将长读长测序评为“2022 年度最佳技术”；制造端 illumina、华大智造、Element Biosciences、Ultima Genomics 等纷纷布局长读长方向；应用端贝瑞基因截至 2022 年底累计服务三代测序检测样本量突破 10 万人份，服务终端客户超过 1500 家。这些进展说明路线方向受到重视，但从科研工具走向规模化临床常规应用，仍需时间验证。
| 维度 | 已明确的进展 | 尚存的不确定性 |
|---|---|---|
| 准确性 | 长读长可覆盖重复序列等短读长难点 | 准确率目前仍只能做到 95% |
| 临床应用 | 复杂单基因病分子诊断受到期刊关注 | 临床商业转化此前寥寥，路径仍在探索 |
| 产业格局 | 多家厂商布局长读长领域 | 二代测序仍占据最大市场份额 |
| 规模化 | 检测样本量与客户数已有积累 | 成本与规模化能力缺乏公开统一口径 |
常见问题
单分子测序为什么能避免逆转录偏向性？
因为该技术无需对样品中核酸进行 PCR 扩增或逆转录，可直接对 DNA 或 RNA 测序，因此能避免对 RNA 病毒测序时必须将 RNA 逆转录为 DNA 扩增所产生的偏向性及可能引入的突变。
第三代测序和第四代测序是两代技术吗？
不是。行业普遍共识是单分子测序技术就是第三代测序技术；所谓“第四代”属于人造的商业代际，主要造成概念混淆，并无实质代际意义。
这条路线当前最大的落地障碍是什么？
一方面准确率目前仍只能做到 95%，另一方面三代测序过去十年市占率不到 10%、临床商业转化寥寥，成本与规模化能力也尚待更充分的公开数据验证。