三代单分子测序无需PCR扩增或逆转录即可直接读取DNA或RNA，其核心技术壁垒在于单分子级信号检测、长读长能力与实时数据输出的系统整合。行业普遍共识将单分子测序归为第三代测序技术，主要包括PacBio与Nanopore两条路线——前者依赖荧光标记碱基的信号识别，后者通过蛋白纳米孔记录碱基穿越时的电流变化。正是这种不经扩增、逐条分子直接读取的机制，构成了区别于二代扩增测序的根本技术门槛。

两条路线，两种单分子读取方式

单分子测序的技术壁垒首先体现在信号检测层面。PacBio技术将荧光标记的不同碱基与待测序列、DNA聚合酶一同置于纳米孔底部，每个纳米孔只允许一条DNA模板进入，通过荧光信号的时间差异识别碱基序列。Nanopore技术则对蛋白纳米孔施加电压差，当motor蛋白牵引DNA或RNA通过纳米孔时，不同碱基产生不同的电流干扰，再通过模式识别算法确定碱基序列。两条路线均不需要PCR扩增，直接对单条核酸分子进行读取。

无需扩增与逆转录带来的能力差异

三代测序的技术特点中，可实时测序是关键一环：文库制备过程简单，无需对样品核酸进行PCR扩增或逆转录，可直接对DNA或RNA测序，并可边测序边输出结果，实现数据的实时分析。此外，纳米孔测序可直接对各类形式的RNA进行测序，避免将RNA逆转录为DNA扩增时产生的偏向性及可能引入的突变。

在读长方面，单分子测序利用碱基穿过纳米孔时电信号的改变实现测序，原则上可检测通过纳米孔的全部核酸序列，因此对测序长度没有限制。作为对比，二代测序需将DNA扩增后切成不超过200BP的片段读取，再用算法还原；三代测序则不用扩增，从头读到尾。这一差异也带来各自局限：二代对重复序列难以精准测出，而三代目前准确率仍只能做到95%。

常见问题

三代单分子测序为什么不需要PCR扩增？

因为其信号检测基于单分子的电信号或化学反应信号，逐条DNA分子单独测序，文库制备过程简单，无需对样品核酸进行PCR扩增或逆转录，可直接对DNA或RNA测序。

单分子测序可以直接测RNA吗？

可以。纳米孔测序能直接对各类形式的RNA进行测序，避免将RNA逆转录为DNA扩增所产生的偏向性及可能引入的突变，这也是其区别于二代扩增测序的重要能力之一。

PacBio和Nanopore两条路线的主要区别是什么？

两者均属单分子测序，但识别方式不同：PacBio利用荧光标记碱基与DNA聚合酶，通过荧光信号时间差异识别碱基；Nanopore则通过蛋白纳米孔记录不同碱基穿越时的电流变化，再用模式识别算法确定序列。