Sanger测序（第一代测序技术）的核心风险在于其高度依赖PCR扩增导致的碱基偏好与突变风险，以及通量低、速度慢、成本高，使其在大规模应用中面临被高通量测序（NGS）和三代测序技术彻底替代的困境。
Sanger测序（双脱氧链终止法）的准确性高达99.999%，测序读长可达1000bp，在单基因病诊断和产前诊断中仍被广泛使用。但其固有缺陷构成了三大核心风险。
PCR扩增带来的偏差与突变风险
Sanger测序离不开PCR扩增，且只能分析单个DNA片段。PCR过程本身会引入碱基偏好和聚合酶错误，导致：
- 碱基偏好：某些GC含量高或重复序列区域难以被均匀扩增，造成测序结果失真。
- 突变风险：PCR循环中可能引入随机突变，尤其在低模板量或长片段扩增时，假阳性率上升。
- 通量瓶颈：每次只能处理一个片段，无法进行基因组层面的并行分析，大规模应用效率极低。
自动化程度低与检测速度慢
Sanger测序的自动化程度低，检测速度慢，对于需要快速检测的疾病（如急性感染病原体鉴定、肿瘤液体活检）不适合。其流程依赖人工操作和毛细管电泳，单次运行耗时数小时，且无法像高通量测序那样同时处理数百万条核酸分子。
被NGS和三代测序技术替代的风险
高通量测序技术（NGS）实现了“大规模并行测序”，使人类全基因组测序成本以“超摩尔定律”速度断崖式下降。从2001年的近1亿美元降至2022年的100美元左右，单例成本已低于Sanger测序数个数量级。NGS和三代测序（如单分子实时测序）在通量、速度和成本上对Sanger形成压倒性优势，正快速侵蚀其市场空间——Sanger仅保留在“金标准”验证、小片段靶向测序等特定场景。
常见问题
为什么Sanger测序仍被视作“金标准”？
因为其准确性高达99.999%，且基本适用于所有突变类型（单核苷酸变异、插入缺失等），在单基因病基因诊断和产前诊断中仍不可替代。
PCR偏差在Sanger测序中如何体现？
PCR扩增对序列组成敏感，高GC区域和重复序列扩增效率低，可能导致测序覆盖不均或丢失关键变异信息；同时，Taq酶的错误率（约10⁻⁵/碱基/循环）在多次循环后累积，增加假阳性风险。
NGS完全替代Sanger还需要多久？
目前NGS在通量和成本上已全面超越，但Sanger在短片段精准验证、法医学个体识别、以及需要100%准确率的“金标准”检测中仍有优势。完全替代取决于NGS能否在保持低成本的同时，将单碱基准确率提升至Sanger同等水平。